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基因測(cè)序技術(shù)與原理
基因測(cè)序技術(shù)與原理
加入時(shí)間:2014-03-03 16:27:00 當(dāng)前新聞點(diǎn)擊率:2722
基因是指攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列,也稱為遺傳因子,是控制性狀的基本遺傳單位?;蛲ㄟ^(guò)指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來(lái)表達(dá)自己所攜帶的遺傳信息,從而控制生物個(gè)體的性狀表現(xiàn)?;蛴锌刂七z傳性狀和活性調(diào)節(jié)的功能。基因通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代,并通過(guò)控制酶的合成來(lái)控制代謝過(guò)程,從而控制生物的個(gè)體性狀表現(xiàn)。基因還可以通過(guò)控制結(jié)構(gòu)蛋白的成分,直接控制生物性狀。因此對(duì)生物從分子生物學(xué)水平上進(jìn)行研究,在醫(yī)學(xué)上對(duì)某種遺傳疾病的研究等都離不開(kāi)對(duì)DNA或RNA的序列進(jìn)行測(cè)定。
基因測(cè)序也是生物學(xué)研究的重要手段,目前應(yīng)用的兩種基因測(cè)序技術(shù)分別為雙脫氧鏈終止法及化學(xué)降解法。南京普東興從事基因測(cè)序研究的業(yè)內(nèi)專家介紹,其原理大相徑庭,但這兩種方法都是同樣生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸,每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn),但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會(huì)均等,因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物,這些寡核苷酸的長(zhǎng)度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長(zhǎng)度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下,對(duì)各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析,只要把幾組寡核苷酸加樣于測(cè)序凝膠中若干個(gè)相鄰的泳道這上,即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。
一、雙脫氧鏈終止法:現(xiàn)行的鏈終止法由加減法序列測(cè)定技術(shù)發(fā)展而來(lái)的。加減法首次引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)、堿基特異性的鏈終止,以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進(jìn)展,但加減法仍然太不精確,也太不得法,因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸(ddTBP)作為鏈終止劑,酶法DNA序列測(cè)定技術(shù)才得到廣泛應(yīng)用。ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們?cè)诿撗鹾颂堑奈恢萌鄙僖粋€(gè)羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過(guò)其三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長(zhǎng)的DNA鏈中,但由于沒(méi)有羥基,它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈,因此,正在增長(zhǎng)的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。這樣,在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后, 鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng),反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈,其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸,它們將分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。
二、化學(xué)降解法:化學(xué)降解法與包括合成反應(yīng)的鏈終止法不同,需要對(duì)原DNA進(jìn)行化學(xué)降解。其基本原理是,首先對(duì)待測(cè)DNA末端進(jìn)行放射性標(biāo)記,再通過(guò)5組(也可以是4組)相互獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解產(chǎn)物,其中每一組反應(yīng)特異性地針對(duì)某一種或某一類堿基進(jìn)行切割。因此,產(chǎn)生5組(或4組)不同長(zhǎng)度的放射性標(biāo)記的DNA片段,每組中的每個(gè)片段都有放射性標(biāo)記的共同起點(diǎn),但長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)針對(duì)的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應(yīng)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,通過(guò)放射自顯影檢測(cè)末端標(biāo)記的分子,并直接讀取待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。 |