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    HCV感染的實(shí)驗(yàn)診斷
    之前，小編已經(jīng)為大家介紹過(guò)了HCV丙型肝炎的特點(diǎn)以及相關(guān)分析。那么目前，通過(guò)相關(guān)醫(yī)療器械檢查，能夠用于HCV感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法主要有兩種，檢測(cè)抗一HCV 和HCV RNA。
    1 抗一HCV檢測(cè)
    1989年5月，美國(guó)Chirob公司用分子克隆法分離到一個(gè)能表達(dá)NANB肝炎病毒特異性蛋白的cDNA克隆5-1—1。又將3個(gè)與5-1—1有共同ORF的重疊克隆連接起來(lái)建立了另一個(gè)克隆C100 。通過(guò)體外診斷試劑研究，C100與超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母中重組表達(dá)的多肽即C oo一。。完整的C·oo一。多肽的N端有154個(gè)SO D氨基酸，5個(gè)由EcoR I位點(diǎn)人工接頭表達(dá)的氨基酸和363個(gè)HCV C100。cDNA編碼的氨基酸；在其C端還有5個(gè)MS2的氨基酸。HCV C oo一?？贵w檢測(cè)系統(tǒng)，是最早應(yīng)用的檢測(cè)方法。世界各地關(guān)于HCV在各種人群中的感染率，基本上都是來(lái)自這種試劑盒的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果證明，HCV是世界上幾乎所有輸血后非甲非乙型肝炎和部分散發(fā)性非甲非乙型肝炎的病因病毒。由于Cloo只含363個(gè)氨基酸，而HCV基因組編碼的蛋白有長(zhǎng)達(dá)3 010個(gè)氨基酸。因此C1oo一?？乖豢贵w系統(tǒng)只代表整個(gè)HCV抗原抗體系統(tǒng)的-4'部分，所以敏感性不高，抗C100。一。出現(xiàn)也太晚，不適于早期診斷，且有些病人根本不出現(xiàn)。該方法使用的抗原含SOD融合蛋白，因此當(dāng)人體存有抗一SOD時(shí)常常出現(xiàn)假陽(yáng)性。但采用RIBA方法能排除因C 100。一。抗原中含SOD部而引起的假陽(yáng)性反應(yīng)，常被用作確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。第一代的RIBA-1試劑，含有C1oo一。、5-1—1兩種抗原(包括SOD序列)，同ELISA相比特異性明顯提高，避免了假陽(yáng)性，但靈敏度都降低了。第二代RIBA-2試劑含有四種抗原。在C 100-3。、5-1-1基礎(chǔ)上又增加了兩個(gè)抗原。C(NSa區(qū))和C2z一。(C區(qū))使用多個(gè)抗原之后，不僅提高了檢測(cè)特異性，而且大大提高了靈敏度，對(duì)于ELISA方法檢出的可疑或弱陽(yáng)性樣本，尤其適用RIBA方法做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。隨著HCV基因序列的闡明，人們發(fā)現(xiàn)C區(qū)基因編碼蛋白較E區(qū)和某些非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白都保守。因此，用C區(qū)基因產(chǎn)物檢測(cè)HCV抗體顯得更加合理，于是相繼建立了一些新的檢測(cè)方法，試圖克服C100?？乖哪承┤毕荩Q(chēng)之為第二代抗一HCV試劑。第二代重組基因多肽檢測(cè)抗一HCV的ELISA技術(shù)是在原包被抗原加入了核心抗原C2z一。、C o、C o。和第一代試劑 (C100—3)相比，第二代試劑具有檢出率高(可提高25 ～30％)，而且抗體出現(xiàn)提早到16～60天。由于重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗一SO D造成的假陽(yáng)性，于是人們開(kāi)始采用人工合成肽段建立檢測(cè)抗一HCV的新試劑。用中國(guó)北方地區(qū)HCV全基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)開(kāi)發(fā)的預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原決定簇可能位點(diǎn)的序列軟件，完成了HCV全基因序列的親水性、親近性、移動(dòng)性分析，已預(yù)測(cè)到HCV抗原決定簇的位點(diǎn)。先對(duì)研制的C區(qū)3個(gè)寡肽(CPA、C e、CPzo)進(jìn)行了抗原活性比較并初步應(yīng)用于臨床，同時(shí)與日本基因工程C區(qū)表達(dá)多肽C 進(jìn)行比較。CP8+CP。e陽(yáng)性率與C 的陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，符合率為87．6 。用所建立的雙PCR試驗(yàn)，比較82例抗一CP與HCVRNA的檢測(cè)結(jié)果，符合率為87．5 。許多國(guó)家的經(jīng)驗(yàn)證明，對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行抗一HCV測(cè)定，可大大降低輸血后患丙肝的風(fēng)險(xiǎn)[20]，降低丙型肝炎的發(fā)病率 ]。因此HCV檢測(cè)可成為早期感染的檢測(cè)指標(biāo)[7 ]。
2 HCVRNA的檢測(cè)
    聚合酶鏈反應(yīng)是目前分子生物學(xué)中最敏感的方法，樣品中只要有一個(gè)拷貝的HCV 序列就有可能被檢出。由于HCV在被感染者體內(nèi)濃度很低，逆轉(zhuǎn)錄RNA PCR(RTPCR)才能檢測(cè)到血清中的HCV RNA。PCR技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)：(1)特異性強(qiáng)?？挂籋CV陽(yáng)性不能直接說(shuō)明受檢者體內(nèi)當(dāng)時(shí)HCV是否存在，而PCR所檢的HCVRNA可作為有無(wú)傳染性的直接指標(biāo)。(2)敏感性高?？砂l(fā)現(xiàn)抗一HCV陰性者HCV感染。(3)陽(yáng)性出現(xiàn)早。可在ALT增高的同時(shí)檢出。黑猩猩感染HCV后第3天即可在血清中檢出HCV RNA。(4)應(yīng)用較廣泛?？蓹z測(cè)組織和體液中RNA。但操作程序較復(fù)雜，技術(shù)要求嚴(yán)格，試驗(yàn)成本高，所以只限于有條件的實(shí)驗(yàn)室使用。1991年由北京醫(yī)科下學(xué)肝病研究所建立了一項(xiàng)直接檢測(cè)HCV PCR的雙重PCR法，亦可稱(chēng)“一步法”。特點(diǎn)是微量(可從100~1血清中提到RNA)、簡(jiǎn)便(不用低溫超速離心機(jī)等設(shè)備)、快速(從提取RNA逆轉(zhuǎn)錄可在4小時(shí)完成)、減少Rnase污染，1～2天內(nèi)可發(fā)報(bào)告。由于PCR的諸多優(yōu)點(diǎn)，只要不斷的改進(jìn)方法，使之更趨簡(jiǎn)便、快速，必將成為HCV感染診斷的重要手段。最近有研究結(jié)果表明，在原RT—PCT的基礎(chǔ)上再進(jìn)行定量PCR，其方法是在樣品PCR反應(yīng)混合液內(nèi)加入。HdTTP摻入，液閃法測(cè)定。H摻入的CPM值以純化已知濃度的cDNAsfuw(
    10pg／每管30UI)，再計(jì)算待測(cè)血清中RNA的動(dòng)態(tài)變化。初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在治療前后血清中RNA的深度變化較大。2例病人用a一干擾素治療的病人中，雖然血清AI 轉(zhuǎn)為正常，但血清中的RNA含量變化不大。提示該方法對(duì)丙型肝炎的療效觀察有一定的參考價(jià)值。
    目前各醫(yī)療器械廠(chǎng)家出售的抗一HCV試劑盒，其間的試劑的靈敏度、特異性存在一定的差異 ，分別由重組基因多肽人工合成多肽組成，基因工程多肽的優(yōu)點(diǎn)是：(1)可包含多個(gè)抗原位點(diǎn)。(2)一旦克隆表達(dá)成功則產(chǎn)量高、價(jià)格低。(3)表達(dá)多肽的穩(wěn)定性好。(4)可將幾個(gè)片段重合使用，有較高的特異性和敏感性。(5)純化簡(jiǎn)單，無(wú)其它蛋白干擾，可做抑制試驗(yàn)。缺點(diǎn)是：(1)克隆表達(dá)技術(shù)要求較高，不易達(dá)到滿(mǎn)意結(jié)果。(2)表達(dá)產(chǎn)物純化困難，含有菌體等其它蛋白干擾。(3)每批產(chǎn)量間穩(wěn)定性比間差異小。合成的EP27及其檢測(cè)結(jié)果，提示了它與第二代抗一HCV試劑的不同點(diǎn) 。